칸나비디올은 칸나비노이드 수용체 독립적 메커니즘을 통해 인간 신경교종 세포 전이를 억제합니다

728x90

Br J Pharmacol. 2005 Apr; 144(8): 1032–1036.

Published online 2005 Feb 7. doi: 10.1038/sj.bjp.0706134

PMCID: PMC1576089

칸나비디올은 칸나비노이드 수용체 독립적 메커니즘을 통해 인간 신경교종 세포 전이를 억제합니다
Cannabidiol inhibits human glioma cell migration through a cannabinoid receptor-independent mechanism

Angelo Vaccani,¹ Paola Massi,² Arianna Colombo,¹ Tiziana Rubino,¹ and Daniela Parolaro^1,*

Author information ► Article notes ► Copyright and License information ►

This article has been cited by other articles in PMC.

Go to:

Abstract

Keywords:

서문 Introduction

칸나비스 사티바(Cannabis sativa)의 활성 성분인 칸나비노이드(Cannabinoids)와 그 유도체는 특정 원형질막 G-단백질 결합 수용체를 통해 광범위한 약리적 효과를 나타냅니다.
2가지 칸나비노이드 수용체인 CB1과 CB2가 포유류 조직에서 복제 및 특성 분석되었습니다.
칸나비노이드는 아데닐레이트 시클라제의 억제를 유도하고, 이온 채널에 영향을 미치며, 세포외- 신호-조절 키나아제(ERK), c-Jun N-말단 키나아제 및 p38 분열촉진제-활성화 단백질 키나아제를 자극하여, 이들이 세포 생존 또는 사망 결정에서 일반적 역할을 할 수 있음을 나타냅니다. (Howlett 등, 2002).
Cannabinoids, the active components of Cannabis sativa, and their derivatives, have a wide spectrum of pharmacological effects exerted through specific plasma membrane G-protein-coupled receptors. Two cannabinoid receptors, CB1 and CB2, have been cloned and characterized from mammalian tissues. Cannabinoids induce the inhibition of adenylate cyclases, influence ionic channels, and stimulate extracellular-signal-regulated kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase, and p38 mitogen-activated protein kinase, indicating that they may play a general role in the cell survival or death decision (Howlett et al., 2002).

최근 보고에 따르면 칸나비노이드는 실험관(in vitro) 및 생체(in vivo)에서 다양한 종류의 암세포의 생존을 억제한다고 보고되어 있습니다(Parolaro 등, 2002; Guzman, 2003).
칸나비노이드는 악성 신경교종 세포, 즉 성인에서 가장 흔한 원발성 대뇌 종양(cerebral tumor)의 세포사멸 (apoptosis)을 유도합니다.
그러나, 이들 화합물의 향정신효과는 의약 용도를 제한합니다.
Numerous recent reports state that cannabinoids inhibit the viability of various types of cancer cells in vitro and in vivo (Parolaro et al., 2002; Guzman, 2003). Cannabinoids induce apoptosis of malignant glioma cells, that is, from the most common primary cerebral tumor in adults. However, the psychotropic effects of these compounds limit their medicinal use.

이전 연구(Massi 등, 2004)에서, 비정신자극 칸나비노이드 화합물인 칸나비디올(cannabidiol, CBD)이 프로그램된 세포사멸을 유도함으로써 in vitro 또는 in vivo에서 신경교종 세포 성장을 제한할 수 있음을 입증했습니다.
하지만 신경교종의 특징적 확산 침윤 성장은 수술 제거를 불가능하게 만들고 이러한 환자의 임상 관리를 실질적으로 복잡하게 만듭니다.
In a previous work (Massi et al., 2004), we demonstrated that the nonpsychoactive cannabinoid compound, cannabidiol (CBD), can limit glioma cell growth in vitro or in vivo, by inducing programmed cell death. However, the characteristic diffuse infiltrative growth of gliomas makes surgical removal impossible and substantially complicates the clinical management of these patients.

일반적으로, 종양 세포 침입은 세포 외 기질의 분자에 접착, 기질 성분의 분해 및 후속의 활성 종양 세포 이동을 포함하는 복잡한 과정입니다.
따라서 신경아교(glioma) 세포 전이를 예방할 수 있는 CBD의 용량에 대한 이해는 중요할 것이며 잠재적 항암제로서의 사용을 향상시킬 수 있을 것입니다.
In general, tumor cell invasion is a complex process involving adhesion to molecules of the extracellular matrix, degradation of matrix component, and subsequent active tumor cell locomotion (migration). Therefore, an understanding of the capacity of CBD to prevent glioma cell migration would be important and could probably improve its use as a potential antitumoral compound.

칸나비노이드는 연구된 세포 유형에 따라 세포 전이, 자극 또는 억제에 복잡한 영향을 미칩니다.
종양 세포 운동성에 대한 그들의 행동에 대해서는 알려진 것이 거의 없습니다.
아난다마이드(Anandamide)는 CB1-의존성 메커니즘을 통해 인간 결장암 세포(SW480)의 전이를 억제합니다(Joseph 등, 2004).
대조적으로, 2-AG는 HL-60 세포(Kishimoto 등, 2003) 및 쥐의 골수성 백혈병 세포(Jordà 등, 2002)의 전이를 증가시킵니다.
CBD의 악성 신경교종(malignant glioma) 세포 전이에 대한 영향은 아직 조사되지 않았기 때문에 이 화합물이 인간 신경교종 세포의 운동성에 어떤 영향을 미치는지 조사하고, CB1 및 CB2 칸나비노이드 수용체의 역할을 평가하는 약리적 관점을 고려했습니다.
The cannabinoids have complex effects on cell migration, stimulating or inhibiting depending on the cell type studied. Little is known about their action on tumor cell motility. Anandamide inhibits the migration of human colon carcinoma cells (SW480) through a CB1-dependent mechanism (Joseph et al., 2004). In contrast, 2-AG increases the migration of HL-60 cells (Kishimoto et al., 2003), and murine myeloid leukemia cells (Jordà et al., 2002). Since CBD's effects on malignant glioma cell migration have not been investigated yet, we investigated how this compound influences the motility of human glioma cells, and also considered the pharmacological viewpoint, assessing the role of cannabinoid receptors CB1 and CB2.

방법론 및 재료 Methods and materials

CBD는 GW Pharm (Salisbury, UK)의 관대한 선물이었습니다.
처음에 에탄올에 100mM의 농도로 녹이고 -20°C에서 보관했습니다.
에탄올 농도를 0.001% 이하로 유지하면서 시험관내 연구를 위해 원하는 농도로 조직 배양 배지로 희석 하였습니다.
SR141716A 및 SR144528은 Dr. F. Barth (Sanfi-Synthélabo Recherche, Montpellier, 프랑스)가 친절하게 공급했습니다.
백일해 독소(PTX)는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, U.S.A.)로부터 구입 하였습니다.
조직 배양 배지 및 모든 보충제는 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다.
CBD was a generous gift from GW Pharm (Salisbury, U.K.). It was initially dissolved in ethanol to a concentration of 100 mm and stored at −20°C. It was further diluted with tissue culture medium to the desired concentration for in vitro studies, keeping the ethanol concentration below 0.001%. SR141716A and SR144528 were kindly supplied by Dr F. Barth (Sanofi-Synthélabo Recherche, Montpellier, France). Pertussis toxin (PTX) was purchased from Sigma-Aldrich (St Louis, MO, U.S.A.). Tissue culture media and all supplements were obtained from Sigma-Aldrich.

세포 배양 Cell culture

5% CO2와 95% 공기를 포함한 가습 분위기에서 37°C로 유지되는 U87 인간 신경교종 세포를 사용했습니다.
4-mM L-글루타민, 100 U ml-1 페니실린, 100mg ml-1 스트렙토마이신, 1% 피루브산 나트륨, 1% 비- 필수 아미노산 및 10% 열-비활성화 태아 소혈청이 첨가된 DMEM에서 75-cm2 플라스크에 세포를 배양 하였습니다.
We used U87 human glioma cells, maintained at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO₂ and 95% air. Cells were cultured in 75-cm² flasks in DMEM supplemented with 4 mm l-glutamine, 100 U ml⁻¹ penicillin, 100 mg ml⁻¹ streptomycin, 1% sodium pyruvate, 1% non-essential amino acids, and 10% heat-inactivated foetal bovine serum.

세포 전이 분석 Cell migration assay

15μg ml-1 fibronectin로 코팅된 공극 직경 8㎛의, 상부 및 하부 구획이 폴리카보네이트 (polycarbonate) 필터(Biomap, Agrate Brianza, 이태리)로 분리된, 48-잘 변형된 Boyden 챔버를 사용한, 화학 주성 실험에서 U87 세포 전이를 조사했습니다.
U87 cell migration was examined in a chemotaxis experiment using a 48-well modified Boyden chamber whose upper and lower compartments were separated by a polycarbonate filter (Biomap, Agrate Brianza, Italy), pore diameter 8 μm, coated with 15 μg ml⁻¹ of fibronectin.

조건화된 토대(CM)는 3일 동안, 완전 배지로, U87 세포의 하위 융합 배양을 배양하여 이루어진 화학유인물질로 작용합니다.
코팅된 필터를 CM이 담긴 하부 챔버 위에 놓았습니다.
혈청이 없는 배지를 음성 대조군으로 사용 하였습니다.
세포를 CBD 또는 장치로 30분 동안 처리한 다음, 3 × 10⁴ 세포 웰-1의 농도로 상부 챔버에 심었습니다.
37°C에서 6시간 인큐베이션한 후, 전이 안된 세포를 필터의 상부 표면으로부터 긁어 냅니다.
Diff-Quick 염색으로 필터 하부면에서 전이된 세포를 염색하고(VWR, Scientific Products, Bridgeport, NJ, U.S.A.), Zeiss 현미경을 사용하여 × 400 배율로 필터당 5 내지 8개의 단위 장을 계수하였습니다.
Conditioned medium (CM) served as the chemoattractant, made by incubating a subconfluent culture of U87 cells with complete medium for 3 days. The coated filter was placed over the bottom chamber containing the CM. Serum-free medium was used as negative control. Cells were treated with CBD or vehicle for 30 min, and then seeded in the upper chamber at a concentration of 3 × 10⁴ cells well⁻¹. After 6 h incubation at 37°C, the nonmigrated cells were scraped off the upper surface of the filter. The migrated cells on the lower side of the filter were stained with Diff-Quick stain (VWR, Scientific Products, Bridgeport, NJ, U.S.A.) and five to eight unit fields per filter were counted at × 400 magnification using a Zeiss microscope.

선택적 반작용제 SR141716 및 SR144528을 사용하는 실험에서, 세포를 30분 동안 반작용제로 전처리하고, CBD로 30분 동안 처리한 다음, 상부 챔버에 파종 시켰습니다.
PTX 연구에서, 세포는 25-cm2 플라스크에서 100 ng ml-1의 농도로 4시간 동안 PTX로 예비 배양 한 다음, 수확하여 상기 보고된 바와 같이 CBD에 노출시켰습니다.
For the experiments using the selective antagonists SR141716 and SR144528, cells were pretreated with the antagonists for 30 min, treated with CBD for another 30 min, and then seeded in the upper chamber. In the PTX studies, cells were preincubated with PTX at a concentration of 100 ng ml⁻¹ in a 25-cm² flask for 4 h, and then harvested and exposed to CBD as reported above.

Western immunoblotting

75-cm² 플라스크에서 성장한 하위융합(subconfluent) 세포에서 세포 추출물을 준비했습니다.
세포를 인산-완충 생리식염수(hosphate-buffered saline) 2회 세척하고 원심분리(centrifugation)로 펠렛화 하였습니다.
펠렛을 용해 완충액으로 재현탁 했고(10 mm Tris–HCl, pH 7.4; 1 mm phenylmethyl-sulfonylfluoride, PMSF; 2 μm aprotinin and 10 μm leupeptin), 초음파 처리로 파쇄 했고, 4°C에서 1시간 동안 10,000×g로 원심분리 하였습니다.
BCA 분석법(Pierce, IL, U.S.A.)으로 단백질 농도를 측정하고, 10% SDS-PAGE에서 40 μg lane⁻¹의 농도로 로딩 하였습니다.
겔을 니트로셀룰로오스 세포막으로 옮겨졌고, Tris-완충 식염수/ Tween-20의 7.5% 우유로 밤새 막았습니다.
이어서, 필터를 CB1에 대해 1:800 및 CB2에 대해 1:400의 희석 하에 수용체 다 클론 항체 (Cayman, Ann Arbor, MI, U.S.A.)로 증명하였습니다.
강화된 화학발광 시스템을 사용하여(ECL, 아머샴, 영국), 고추냉이 퍼옥시다제-콘쥬게이트된 항-토끼 IG (Dako, 덴마크, 1:3000)을 인큐베이션하여 면역 반응성 단백질을 검출하였습니다.
We prepared cell extracts from subconfluent cells grown in 75-cm² flasks. Cells were washed twice in phosphate-buffered saline, and pelleted by centrifugation. Pellets were resuspended in lysis buffer (10 mm Tris–HCl, pH 7.4; 1 mm phenylmethyl-sulfonylfluoride, PMSF; 2 μm aprotinin and 10 μm leupeptin), disrupted by sonication, and centrifuged at 10,000 × g for 1 h at 4°C. The protein concentration was determined by BCA assay (Pierce, IL, U.S.A.) and loaded at a concentration of 40 μg lane⁻¹ in 10% SDS–PAGE. The gel was transferred to a nitrocellulose membrane, blocked with 7.5% milk in Tris-buffered saline/Tween-20 overnight. The filters were then probed with the receptor polyclonal antibodies (Cayman, Ann Arbor, MI, U.S.A.) at a dilution of 1:800 for CB1 and 1:400 for CB2. Immunoreactive proteins were detected by incubation with horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IG (Dako, Denmark, 1 : 3000) using the enhanced chemiluminescence system (ECL, Amersham, U.K.).

통계적 분석 Statistical analysis

세포 전이 저지는 비히클에 대한 저해의 백분율로서 나타냈습니다(최대 자극).
Dunnett 's test에 의한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 그룹을 비교했습니다.
반작용를 사용한 연구에서 일원 배치 ANOVA와 Tukey의 검사가 사용되었습니다.
Inhibition of cell migration was expressed as a percentage of inhibition with the vehicle (maximal stimulation). One-way ANOVA followed by Dunnett's test was used to compare groups. In the studies with antagonists, one-way ANOVA followed by Tukey's test was used.

Results

CBD에 의한 인간 신경교종 세포 전이 저지
Inhibition of human glioma cell migration by CBD

그림1에 있는 바와 같이, 인간 신경교종 세포의 배양 배지에 CBD를 6시간 동안 첨가하면, CM에 의해 유도된 전이의 농도-의존적 저지가 일어나며, 농도 범위 0.01 ~ 9 μM로 추정된 C₅₀ of 5.05±1.1 μm로, 이미 보고한 것처럼 (Massi et al., 2004) 세포 생존 능력에 영향을 미치지 않습니다.
세포가 4시간 동안 항온 처리되었을 때도 유사한 결과가 관찰되었습니다(데이터는 나타내지 않았음).
As shown in Figure 1, the addition of CBD to the culture medium of human glioma cells for 6 h resulted in concentration-dependent inhibition of the migration induced by CM, with an estimated IC₅₀ of 5.05±1.1 μm in a concentration range of 0.01–9 μm, that had no effect on cell viability, as we have already reported (Massi et al., 2004). Similar results were observed when cells were incubated for 4 h (data not shown).

그림1

CBD에 의한 U87 전이의 농도-의존적 저지.
CM을 Boyden 챔버의 하부 구획에 첨가하고 세포를 CBD 존재 하에 상부에 첨가한 다음 U87 세포 전이를 정량화 하였습니다.
세포가 점점 더 많이 노출되었습니다 ...
Concentration-dependent inhibition of U87 migration by CBD. CM was added in the lower compartment of the Boyden chamber and cells were added in the upper part in the presence of CBD, and then U87 cell migration was quantified. Cells were exposed to increasing ...

CBD-주입 세포 전이의 저지에 관한 칸나비노이드 수용체 반작용제의 효과
Effects of cannabinoid receptor antagonists on CBD-induced inhibition of cell migration

지금까지 기술된 중추신경계에 대한 칸나비노이드의 효과의 대부분은 칸나비노이드 수용체를 통해 발휘되는 것으로 여겨집니다.
CBD에 의한 세포 전이 억제가 이들 수용체의 자극에 의존하는 지를 결정하기 위해, 먼저 세포주 (cell lines)에서 수용체의 존재를 확인했습니다.
Most of the effects of cannabinoids on the central nervous system described so far are believed to be exerted through the cannabinoid receptor. To determine whether CBD-induced inhibition of cell migration was dependent on the stimulation of these receptors, first we checked the presence of the receptors in our cell lines.

그림2a는 CB1 및 CB2 수용체에 대한 immunoblot 실험의 결과를 보여줍니다.
CB21이 이미 증명된 양성 대조군으로 사용된 쥐 신경교종 세포 C6 및 인간 신경교종 세포주 U373에서 관찰된 밴드와 비교하여 약 59kDa 분자량의 단일 밴드(Song & Howlett, 1995)가 U87 세포에 대해 수득 되었습니다( Sanchez 등, 1998).
그림2b는 약 40 kDa의 분자량을 갖는 인간 신경교종 세포에서의 칸나비노이드 수용체 CB2의 발현을 보고하며, 이것은 수용체의 상이한 글라이코실화된 형태로 인해 분자량이 상이한 2가지 형태를 발현하는 비장에서 CB2 수용체와 유사합니다(Carlisle et al., 2002).
Figure 2a shows the results of immunoblot experiments for CB1 and CB2 receptors. A single band of approximately 59 kDa molecular weight (Song & Howlett, 1995) was obtained for U87 cells, comparable with the band observed in murine glioma cells C6 and human glioma cell line U373 used as positive control, where CB1 have already been demonstrated (Sanchez et al., 1998). Figure 2b reports the expression of the cannabinoid receptor CB2 in human glioma cells, with a molecular weight of approximately 40 kDa, which is comparable with CB2 receptors in the spleen that express two forms differing in molecular weight possibly because of different glycosylated forms of the receptors (Carlisle et al., 2002).

그림2

U87 인간 신경교종 세포에서 CB1 및 CB2 발현.
(a) CB1에 대한 U87 및 U373 세포로부터의 단백질 균질물의 Western immunoblotting.
C6의 용해물(양성 대조군), U87 및 U373 세포에서 반응한 단백질(40 μg lane⁻¹)은 ...
CB1 and CB2 expression in U87 human glioma cells. (a) Western immunoblotting of protein homogenates from U87 and U373 cells for CB1. Proteins (40 μg lane⁻¹) from lysates of C6 (as positive control), U87 and U373 cells reacted ...

CB1 수용체와 CB2 수용체에 각각 선택적으로 특이한 반작용제인 SR141716A와 SR144528을 사용했습니다.
그림3에서 볼 수 있듯이 CBD는 사실상 세포 전이를 절반으로 줄였습니다.
이 억제는 세포 생존력 및 전이성을 변화시키지 않는 2가지 농도에서 사용되는 반작용제 중 하나 (CBD의 효과가 고전적 칸나비노이드 수용체에 의해 매개되지 않음을 나타냄)에 의해 예방되지 않았습니다.
또한, 세포 전이에 대한 CBD-유도된 억제를 위해 2가지 칸나비노이드 수용체 반작용제 및 바닐로이드 반작용제, capazepine의 조합을 테스트 하였습니다.
그림3b에 보고된 바와 같이, 2가지 칸나비노이드 반작용제(모두 1μM 농도)의 조합은 CBD에 의해 유도된 억제를 제한하지 못했습니다.
또한 TRPV1 반작용제인 capsazepine은 0.625 μM의 농도로 사용되었는데 (세포 운동성 자체를 변경시키지 않음, 데이터는 나타내지 않음), CBD 효과에 반작용하지 않았습니다(그림3b).
We then proceeded using specific antagonists selective for CB1 and CB2 receptors, respectively, SR141716A and SR144528. As reported in Figure 3, CBD virtually halved cell migration. This inhibition was not prevented by either of the antagonist, both used at two concentrations that did not alter cell viability and migration (data not shown), indicating that CBD's effect was not mediated by the classical cannabinoid receptors. In addition, we tested either the combination of the two cannabinoid receptor antagonists and the vanilloid antagonist, capsazepine, for the CBD-induced inhibition on cell migration. As reported in Figure 3b, the combination of the two cannabinoid antagonists (both at a concentration of 1 μm) failed to limit the inhibition induced by CBD. Also the TRPV1 antagonist, capsazepine used at a concentration of 0.625 μm (that did not alter cell motility per se, data not shown), failed to antagonize the CBD effects (Figure 3b).

(a) CBD의 세포 전이 억제는 CB1 및 CB2에 대한 선택적 반작용제, SR141716 (대각선 바) 및 SR144528 (교차-해칭 바)에 대한 선행 처리에 의해 예방되지 않습니다.
세포를 반작용제와 함께 30분간 예비 배양한 후
(a) CBD inhibition of cell migration is not prevented by pretreatment with selective antagonists for CB1 and CB2, respectively, SR141716 (diagonal bars) and SR144528 (cross-hatched bars). Cells were preincubated for 30 min with the antagonists, ...

Figure 3

Inhibitory effect of CBD on cell migration after PTX treatment

이후의 실험에서 고전적 칸나비노이드 수용체 및/또는 Gi/o-단백질- 결합 수용체와의 상호작용을 더 배제하기 위해, 4시간 동안 PTX 100 ng ml-1로 세포를 전 처리하였습니다.
이것은 미처리 세포와 비교하여 약 15% 정도 세포 전이를 부분적으로 손상시킵니다(데이터 미기재).
그림4에 보고된 바와 같이, PTX는 CBD가 종양 세포전이를 억제하는 것을 예방하지 못했습니다.
To further exclude any interaction with classical cannabinoid receptors and/or Gi/o-protein-coupled receptors, in subsequent experiments, we pretreated cells with 100 ng ml⁻¹ of PTX for 4 h. This partially impairs cell migration by about 15% compared with unpretreated cells (data not shown). As reported in Figure 4, PTX did not prevent CBD inhibiting tumor cell migration.

Figure 4

CBD로 유도된 세포 전이는 PTX로 전 처리함으로써 예방되지 않는다.
세포를 4시간 동안 100ng ml-1 PTX로 전 처리한 다음, CBD 또는 도구B로 30분 동안 처리하고 (개방 컬럼), 상부 구획에 적재하였습니다.
CBD-induced cell migration is not prevented by pretreatment with PTX. Cells were pretreated with 100 ng ml⁻¹ PTX for 4 h, then treated with CBD or vehicle B for 30 min (open columns) and loaded in the upper compartment ...

Discussion

악성 신경교종은 고도로 침윤성이고 증식성 종양입니다.
신경교종 세포는 성장의 특징적 패턴을 따라 인접한 정상적 뇌 구조와 주변의 큰 혈관을 침범합니다.
따라서 악성 신경교종 환자의 예후를 개선하기 위해서는 전이를 억제하는 것이 중요합니다.
이전의 연구에서, 비 감각성 마리화나 유도체인 CBD가 시험관 및 생체시험에서 인간 신경교종 세포주 U87 및 U373의 생존 가능성을 저해하여 잠재적 의학적 용도를 제시했습니다.

현재의 연구는 CBD가 시험관 시험에서 U87 인간 신경교종(glioma) 세포의 전이를 억제할 수 있다는 것을 처음으로 보여줍니다.
주된 연구는 면역세포나 내피세포에 관한 것이지만 칸나비노이드의 세포 전이에 대한 영향은 이미 보고된 바 있지만 때로는 세포 유형에 따라 상반되는 자료가 됩니다.
체내칸나비노이드 2-AG에 의한 CB2 수용체의 자극은 HL60과 쥐 미글리아의 이동을 증가시키는 것으로 보고되었습니다(Kishimoto 등, 2003; Walter 등, 2003).
대조적으로, THC 또는 합성 작용제 CP-55,940은 수용체인 CB1 및 CB2를 모두 포함하는 대식세포 이동을 억제하였습니다(Sacerdote 등, 2000; Roth 등, 2002).
아난다마이드는 또한 SW480 결장암 세포 전이를 억제할 수 있다고 기술되어 왔습니다(Joseph 등, 2004).

여기에서 CBD가 0.01에서 9 μM까지 농도의 범위에서 신경교종 세포 이동의 농도 관련 저해를 일으킨다는 것을 발견했습니다(Massi 등, 2004).
CBD의 작용 메커니즘을 밝히기 위한 첫 번째 시도에서, 종양 세포전이의 억제가 고전적 칸나비노이드 수용체에 의한 것인지 여부를 조사했습니다.
CB1 반작용제 SR141716 또는 CB2 반작용제 SR144528은 CBD에 반응하여 세포전이 억제를 예방 하지 않았습니다.
또한, 두 카나비노이드 반작용제 또는 TRPV1 수용체 반작용제 capsazepine의 조합은 이전 데이터를 강화하고, CBD의 억제 효과를 반작용하는 실패(Massi 등., 2004) 칸나비노이드와 바닐 로이드 수용체와 무관 결과 CBD의 항 증식 효과에 .

CBD의 약리적 효과에서 칸나비노이드 수용체의 역할은 논란의 여지가 있습니다.
결합 연구는 칸나비노이드 수용체(Bisogno 등, 2001)에 결합할 수 있음을 보여 주었지만, 약리학 연구에서 선택적 반작용제는 시험관 시험에서 CBD의 효과를 차단하지 못했습니다(Massi 등, 2004).
Gi/o-coupled 수용체와의 상호작용을 배제하기 위해 CBD가 잠재적으로 결합할 수 있는 세 번째 유형의 칸나비노이드 수용체가 존재하므로 (Pertwee & Ross, 2002), 세포에 대한 CBD의 영향을 평가했으나, CBD 유도 억제를 막을 수 없는 PTX 존재 하에서도 CBD가 칸나비노이드 및/또는 Gi/o 단백질과 결합 된 다른 수용체를 통해 작용하지 않음을 의미합니다.
이 데이터는 칸나비노이드 수용체와의 상호작용과 관련 없는 인간 신경교종 세포에 대한 CBD의 프로포탐스틱 효과에 관한 이전의 결과와 일치합니다.

CBD가 Ab-CBD에 민감한 내피 수용체(Jarai 등, 1999)라는 아직 완전히 특징 지워지지 않은 수용체와의 잠재적 결합을 통해 쥐 미세아교 세포 BV-2 세포 이동을 자극한다고 보고되었으므로 (Walter 등, 2003), CBD의 신경아교종에 대한 효과가 반작용제 특성을 나타내는 유사한 유형의 수용체와의 상호작용에 기인한다고 추측할 수 있습니다.

결론적으로, 본 연구는 CBD가 종양 세포전이를 억제할 수 있다는 것을 처음으로 입증합니다.
이 작용 메커니즘이 현재로서는 명확하지 않지만 고전적 칸나비노이드 수용체 및/또는 Gi/o 커플링 수용체의 약제를 배제할 수 있습니다.
데이터는 쥐 갑상선암 세포에서 met-fluoro-anandamide (Portella 등, 2003)에 대해 이전에 입증된 것과 같이 항전이제로서의 칸나비노이드의 사용을 추가로 지지합니다.
CBD의 알려진 항증식성 및 세포사멸 특징과 함께(Massi 등, 2004), 이 항전이 특성은 잠재적 항암제로서의 사용에 대한 증거를 강화 시킵니다.
Malignant gliomas are highly infiltrating, proliferative tumors. Glioma cells follow a characteristic pattern of growth, invading the adjacent normal brain structures and surrounding large blood vessels. Inhibiting migration is therefore a vital step towards improving the prognosis of patients with malignant gliomas. In a previous study, we demonstrated that CBD, a nonpsychotropic derivative of marijuana, impaired the viability of human glioma cell lines U87 and U373 in vitro and in vivo, suggesting its potential medical use.

The present study shows, for the first time, that CBD can inhibit the migration of U87 human glioma cells in vitro. The cannabinoids' effects on cell migration have already been reported, although the main studies were on immune cells or endothelial cells, resulting sometimes in conflicting data depending on the cell type. Stimulation of the CB2 receptor by the endocannabinoid 2-AG was reported to increase the migration of HL60 and mouse microglia (Kishimoto et al., 2003; Walter et al., 2003). In contrast, THC or the synthetic agonist CP-55,940 inhibited macrophage migration, involving both receptors, CB1 and CB2 (Sacerdote et al., 2000; Roth et al., 2002). Anandamide has also been described as being able to inhibit the migration of SW480 colon carcinoma cells (Joseph et al., 2004).

Here, we found that CBD caused concentration-related inhibition of glioma cell migration in a range of concentrations starting from 0.01 up to 9 μm, which did not affect cell viability, as we have already reported (Massi et al., 2004). In a first attempt to clarify the mechanism of action of CBD, we investigated whether the inhibition of tumor cell migration was due to the classical cannabinoid receptors. Neither the CB1 antagonist SR141716 nor the CB2 antagonist SR144528 prevented the cell migration inhibition in response to CBD. Also, the combination of the two cannabinoid antagonists or the TRPV1 receptor antagonist capsazepine failed to antagonize the inhibitory effects of CBD, strengthen our previous data (Massi et al., 2004) on the antiproliferative effects of CBD that resulted independent of cannabinoid and vanilloid receptors.

The role of cannabinoid receptors in CBD's pharmacological effects is anyway controversial. Binding studies have shown it could bind to cannabinoid receptors (Bisogno et al., 2001), but in our pharmacological study, the selective antagonists did not block CBD's effects in vitro (Massi et al., 2004). Since the existence of a third type of cannabinoid receptor has been suggested (Pertwee & Ross, 2002) to which CBD could potentially bind, with a view to excluding any interaction with Gi/o-coupled receptors, we evaluated the effect of CBD on cell migration also in the presence of PTX which, however, was unable to prevent CBD-induced inhibition, meaning that CBD does not act through cannabinoid and/or other receptors coupled to Gi/o proteins. These data are in line with our previous results about the proapoptotic effect of CBD on human glioma cells, which was not related to its interaction with cannabinoid receptors.

Since CBD has been reported to stimulate mouse microglia BV-2 cell migration (Walter et al., 2003) through potential binding with a still not fully characterized receptor named ‘endothelial receptor sensitive to Ab-CBD' (Jarai et al., 1999), we could speculate that CBD's effect in glioma might be due to an interaction with a similar type of receptor showing inverse agonist properties.

In conclusion, the present study demonstrates, for the first time, that CBD can inhibit the migration of tumoral cells. Although the mechanism of this action is not clear at the moment, we can exclude any engagement of classical cannabinoid receptors and/or Gi/o-coupled receptors. Our data further support the use of cannabinoids as antimetastatic drugs as previously demonstrated for met-fluoro-anandamide on rat thyroid cancer cell (Portella et al., 2003). This antimigratory property, together with the known antiproliferative and apoptotic features of CBD (Massi et al., 2004), strengthen the evidence for its use as a potential antitumoral agent.

Acknowledgments

We are indebted to GW Pharmaceuticals for kindly providing CBD; we are also grateful to Dr F. Barth (Sanofi Synthèlabo Recherche) for providing the compound SR141716A and SR144528. This work was supported by a grant from the Cannabinoid Research Institute, affiliated with GW Pharmaceuticals, Oxford, U.K.

Abbreviations

ab-CBD	abnormal-cannabidiol
2-AG	2-arachidonoylglycerol
CB1	cannabinoid receptor type 1
CB2	cannabinoid receptor type 2
CBD	Cannabidiol
CM	conditioned medium
CPZ	capsazepine
PMSF	phenylmethyl-sulfonylfluoride
PTX	Pertussis toxin
SR141716A	N-(piperidin-l-yl)-5-(4-chlorophenyl)-l-(2,4-dichlorophenyl)-4-methyl-H-pyrazole-3 carboxyamidehydrochloride
SR144528	N-[(lS)-endo-l,3,3-trimethylbicyclo[2,2,1]heptan-2-yl]-5-(4-chloro-3-methylphenyl)-l-(4-methylbenzyl)-pyrazole-3-carboxamide
THC	Δ⁹-tetrahydrocannabinol
TRPV1	transient receptor potential channel vanilloid subfamily member 1

References

· BISOGNO T., HANUS L., DE PETROCELLIS L., TCHILIBON S., PONDE D.E., BRANDI I., MORIELLO A.S., DAVIS J.B., MECHOULAM R., DI MARZO V. Molecular targets for cannabidiol and its synthetic analogues: effect on vanilloid VR1 receptors and on the cellular uptake and enzymatic hydrolysis of anandamide. Br. J. Pharmacol. 2001;134:845–852. [PMC free article] [PubMed]

· CARLISLE S.J., MARCIANO-CABRAL F., STAAB A., LUDWICK C., CABRAL G.A. Differential expression of the CB2 cannabinoid receptor by rodent macrophages and macrophage-like cells in relation to cell activation. Int. Immunopharmacol. 2002;2:69–82. [PubMed]

· GUZMAN M. Cannabinoids: potential anticancer agents. Nat. Rev. Cancer. 2003;3:745–755. [PubMed]

· HOWLETT A.C., BARTH F., BONNER T.I., CABRAL G., CASELLAS P., DEVANE W.A., FELDER C.C., HERKENHAM M., MACKIE K., MARTIN B.R., MECHOULAM R., PERTWEE R.G. International Union of Pharmacology. XXVII. Classification of cannabinoid receptors. Pharmacol. Rev. 2002;54:161–202.[PubMed]

· JARAI Z., WAGNER J.A., VARGA K., LAKE K.D., COMPTON D.R., MARTIN B.R., ZIMMER A.M., BONNER T.I., BUCKLEY N.E., MEZEY E., RAZDAN R.K., ZIMMER A., KUNOS G. Cannabinoid-induced mesenteric vasodilation through an endothelial site distinct from CB1 or CB2 receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999;96:14136–14141. [PMC free article] [PubMed]

· JORDÀ M.A., VERBAKEL S.E., VALK P.J., VANKAN-BERKHOUDT Y.V., MACCARRONE M., FINAZZI-AGRO A., LOWENBERG B., DELWEL R. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 2002;99:2786–2793. [PubMed]

· JOSEPH J., NIGGEMANN B., ZAENKER K.S., ENTSCHLADEN F. Anandamide is an endogenous inhibitor for the migration of tumor cells and T lymphocytes. Cancer Immunol. Immunother. 2004;1853:723–728.[PubMed]

· KISHIMOTO S., GOKOH M., OKA S., MURAMATSU M., KAJIWARA T., WAKU K., SUGIURA T. 2-Arachidonoylglycerol induces the migration of HL-60 cells differentiated into macrophage-like cells and human peripheral blood monocytes through the cannabinoid CB2 receptor-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 2003;278:24469–24475. [PubMed]

· MASSI P., VACCANI A., CERUTI S., COLOMBO A., ABBRACCHIO M.P., PAROLARO D. Antitumor effects of cannabidiol, a nonpsychoactive cannabinoid, on human glioma cell lines. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004;308:838–845. [PubMed]

· PAROLARO D., MASSI P., RUBINO T., MONTI E. Endocannabinoids in the immune system and cancer. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 2002;66:319–332. [PubMed]

· PERTWEE R.G., ROSS R.A. Cannabinoid receptors and their ligands. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 2002;66:101–121. [PubMed]

· PORTELLA G., LAEZZA C., LACCETTI P., DE PETROCELLIS L., DI MARZO V., BIFULCO M. Inhibitory effects of cannabinoid CB1 receptor stimulation on tumor growth and metastatic spreading: actions on signals involved in angiogenesis and metastasis FASEB J. 2003171771–1773.(Epub 2003 Jul 03) [PubMed]

· ROTH M.D., BALDWIN G.C., TASHKIN D.P. Effects of delta-9-tetrahydrocannabinol on human immune function and host defense. Chem. Phys. Lipids. 2002;121:229–239. [PubMed]

· SACERDOTE P., MASSI P., PANERAI A.E., PAROLARO D. In vivo and in vitro treatment with the synthetic cannabinoid CP55, 940 decreases the in vitro migration of macrophages in the rat: involvement of both CB1 and CB2 receptors. J. Neuroimmunol. 2000;109:155–163. [PubMed]

· SANCHEZ C., GALVE-ROPERH I., CANOVA C., BRACHET P., GUZMAN M. Delta9-tetrahydrocannabinol induces apoptosis in C6 glioma cells. FEBS Lett. 1998;436:6–10. [PubMed]

· SONG C., HOWLETT A.C. Rat brain cannabinoid receptors are N-linked glycosylated proteins. Life Sci. 1995;56:1983–1989. [PubMed]

· WALTER L., FRANKLIN A., WITTING A., WADE C., XIE Y., KUNOS G., MACKIE K., STELLA N. Nonpsychotropic cannabinoid receptors regulate microglial cell migration. J. Neurosci. 2003;23:1398–1405.[PubMed]

Articles from British Journal of Pharmacology are provided here courtesy of The British Pharmacological Society

저작자표시 비영리 변경금지

칸나비노이드 CBD 오일

칸나비디올은 칸나비노이드 수용체 독립적 메커니즘을 통해 인간 신경교종 세포 전이를 억제합니다

댓글

티스토리툴바